“髓减致痿”病机的实验研究

骨质疏松症属于中医“骨痿”范畴。中医理论认为，肾藏精主骨生髓，精足则髓足，骨骼得养则强健有力;精亏则髓减，骨失其养则脆弱易折，就会发生“骨痿”，即骨质疏松症。本研究拟采用动物实验，从现代医学角度探讨中医“髓减致痿”理论的科学性，并为中医“肾主骨”理论提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物SPF级雌性SD大鼠60只，体质量(210±10)g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(许可证号SCXK-(军)2007-004)，饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物室(实验动物使用许可证号SYXK(京)2010-0032)。1.1.2药物左归丸药液组成:熟地24g，山药12g，山萸肉12g，莬丝子12g，枸杞子12g，川牛膝9g，龟板胶12g，鹿角胶12g。常规水煎减压浓缩，制备成浓度为0.968g生药/ml的药液。戊酸雌二醇:拜耳医药保健有限公司广州分公司产品(批号234A，1mg/片)。临用时，将戊酸雌二醇碾碎后，用纯净水制成浓度为0.0092mg/ml的混悬液。

1.1.3主要试剂和仪器主要试剂:甲基丙烯酸甲酯为天津市福晨化学试剂厂产品(批号20130407);甲基丙烯酸丁酯为国药集团化学试剂有限公司产品(批号20120411);苯甲酸甲酯为天津市光复精细化工研究所产品(批号20100115);聚乙二醇400为国药集团化学试剂有限公司产品(批号20120714);过氧化苯甲酰为国药集团化学试剂有限公司产品(批号T20090409);N，N-二甲基对甲苯胺为ALDＲICH公司产品(批号04327MB-235)。主要仪器:Skyscan1174Micro-CT(比利时，Bruker公司);Ｒeicheit-Jung2040切片机(德国，Leica公司);DM6000B正置显微镜(德国，Leica公司);QwinProV3.5.0图像分析系统(德国，Leica公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组及处理将60只SD雌性大鼠以体质量按随机数字表法分为空白对照组12只，假手术组12只，造模组36只。造模组大鼠按照文献［1］方法切除大鼠双侧卵巢，假手术组仅摘除卵巢附近的部分脂肪组织但不摘除卵巢。术后10d，再将造模组36只大鼠以体质量按随机数字表法分为模型组、阳性对照组及补肾组各12只。然后开始灌胃给药，补肾组灌胃给予0.968g生药/ml的左归丸药液，给药体积为1ml/100g体质量，给药剂量为9.68g生药/kg体质量;阳性对照组给予0.0092mg/ml的戊酸雌二醇混悬液，给药体积为1ml/100g体质量，给药剂量为0.092mg/kg。每天灌胃1次，连续6d，休息1d再给药6d，如此连续给药3个月。每周称重1次，据此调整给药量。空白对照组、假手术组和模型组按上法给予等体积的纯净水。末次给药后，将各组大鼠用戊巴比妥钠(45mg/kg体质量)腹腔注射麻醉，然后迅速处死。取右侧胫骨及股骨4%多聚甲醛固定，分别用于不脱钙骨切片制作和MicroCT检测。

1.2.2指标检测方法(1)MicroCT检测。采用Micro-CT对各组大鼠的股骨进行扫描。将大鼠右侧股骨从固定液中取出后置于生理盐水中浸泡，为防止扫描过程中样本出现脱水和移位，扫描时将股骨用浸有生理盐水的湿纸巾包绕后放到样本管中，固定在MicroCT载物台上。电压50kV，电流800μA，以180°扫描角度、12μm扫描分辨率、1304×1024视野大小沿股骨长轴方向对股骨远端进行扫描。将生长板下1mm定为扫描参考线，扫描参考线以下1.5mm的区域设定为三维重建兴趣区域(rangeofinterestsＲOI)，用N-Ｒecon软件进行骨小梁三维图像重建，用CT-AN软件进行三维分析，获得骨体积分数BV/TV(%)，即所选区域内骨小梁总体积与样本总体积之比;(2)骨组织形态计量学指标检测。取右侧胫骨近端1/3去除软组织，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，塑料包埋。在Ｒeicheit-Jung2040切片机上，用钨钢刀分别切出5μm的纵向不脱钙骨切片，甲苯胺蓝染色。参照文献［2］所述方法，采用QwinProV3.5.0图像分析系统，对不脱钙骨切片的以下指标进行计量:①骨小梁体积百分比(TBV%):骨小梁体积占被测骨髓腔总体积的百分比是衡量骨量水平的主要标志;②骨小梁吸收表面百分比(TＲS%):凹凸不平、不规则的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比:③骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨细胞被覆的类骨质表面占骨小梁表面的百分比。骨丢失率(%)=(每只大鼠的TBV%值－空白对照组大鼠TBV%平均值)/空白对照组大鼠TBV%平均值×100%。骨丢失率为正值时表示骨量增加，绝对值越大表示骨量增加越多;为负值时，表示骨量丢失，绝对值越大表示骨量丢失越多［3］。骨髓腔内脂肪细胞体积百分比(ABS%):骨髓腔内脂肪细胞的面积占被测骨髓腔面积的百分比。

1.3统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差(珋x±s)表示，正态分布采用单因素方差分析，非正态分布数据采用Kruskal-Wallis1-wayANOVA(ksamples)检验。

2结果

2.1各组大鼠股骨BV/TV的变化

表1图1比较，与假手术组比较，模型组、补肾组和阳性对照组大鼠股骨的BV/TV显著减少;与模型组比较，补肾组和阳性对照组大鼠股骨的BV/TV值显著增加。

表1各组大鼠股骨BV/TV变化比较［例(%)］

组别例数BV/TV

空白对照组1217.15±2.06

假手术组1216.54±2.27

模型组128.12±1.69＊＊

阳性对照组1212.31±2.05*##

补肾组1211.01±2.33＊＊#

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.05，##P＜0.01

2.2各组大鼠胫骨TBV%及骨丢失率的变化

表2显示，模型组、补肾组和阳性对照组大鼠胫骨的TBV%显著低于假手术组;而补肾组和阳性对照组的TBV%显著高于模型组。与假手术组比较，模型组、补肾组和阳性对照组大鼠胫骨的骨丢失率(绝对值)显著增加;而与模型组比较，补肾组和阳性对照组的骨丢失率(绝对值)显著减少。

表2各组大鼠胫骨TBV%及骨丢失率的变化

组别例数TBV%骨丢失率(%)

空白对照组1231.63±3.61—

假手术组1230.64±4.25－3.42±6.46

模型组1216.43±3.29＊＊－48.05±10.41＊＊

阳性对照组1224.12±2.94＊＊##－23.79±9.30＊＊##

补肾组1221.31±3.09*##－32.65±9.77＊＊##

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.05，##P＜0.01

2.3各组大鼠胫骨TＲS%、TFS%及TＲS/TFS的变化

模型组、补肾组和阳性对照组与假手术组比较，大鼠胫骨TＲS%、TFS%和TＲS/TFS均显著增加;而与模型组比较，补肾组和阳性对照组的3个指标均显著减少。

表3各组大鼠胫骨TＲS%、TFS%及TＲS/TFS的变化

组别例数TＲS%TFS%TＲS/TFS

空白对照组122.38±0.554.78±0.680.51±0.14

假手术组122.32±0.744.52±0.530.52±0.17模型组129.29±2.39＊＊7.76±0.72＊＊1.22±0.39＊＊

阳性对照组124.04±1.33＊＊##5.61±0.94*##0.74±0.27*##补肾组125.04±1.06＊＊##6.39±0.75＊＊##0.80±0.19＊＊##

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.05，##P＜0.01

2.4各组大鼠骨髓腔中脂肪细胞变化

2.4.1光镜下观察图2显示，模型组大鼠胫骨骨小梁较空白对照组和假手术组显著减少，其排列稀疏，间距加宽，小梁之间连接差。髓腔中的脂肪细胞呈圆形或类圆形的空泡状，模型组中的脂肪细胞较空白对照组和假手术组显著增多，而其他骨髓细胞相对减少。补肾组和阳性对照组的骨小梁较模型组明显增多，而脂肪细胞明显减少，其他骨髓细胞相对增多。

2.4.2各组大鼠胫骨骨髓腔中ABS%的变化表4显示，与假手术组比较，模型组、阳性对照图2各组大鼠胫骨骨髓腔中脂肪细胞分布情况注:a:空白对照组;b:假手术组;c:模型组;d:阳性对照组e:补肾组;箭头所指的白色部分是骨髓腔中的脂肪细胞组和补肾组大鼠胫骨骨髓腔中ABS%显著增加;与模型组比较，补肾组和阳性对照组ABS%显著减少。

表4各组大鼠胫骨骨髓腔内ABS%的变化

组别例数ABS%

空白对照组123.73±1.01

假手术组123.52±0.83

模型组1216.63±2.93＊＊

阳性对照组1210.15±2.24＊＊##

补肾组129.46±2.47＊＊##

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.05，##P＜0.01

与空白对照组比较，假手术组的上述指标均未发生明显改变，从而排除了手术因素对实验的影响。

3讨论

骨质疏松症属于中医“骨痿”范畴［4］。“骨痿”之名首见于《黄帝内经》。《素问·痿论》云:“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿”;“肾者水脏也，今水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿。”明确指出“髓减”“髓虚”是导致“骨痿”的重要原因。中医理论认为，肾藏精主骨生髓。如《素问·六节脏象论》:“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也……其充在骨”;《素问·阴阳应象大论》:“肾生骨髓”;《素问·痿论》:“肾主身之骨髓”，都将肾-精-髓-骨的生理功能紧密结合在一起。正如《中西汇通医经精义》所言:“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者肾之合也。髓者，肾精所生，精足则髓足，髓在骨内，髓足则骨强。”由此可见，肾实精足则骨髓生化有源，骨髓充足骨得以充分滋养而坚固有力;若肾虚精少、骨髓化生乏源、骨髓减少、骨乏其养就会导致骨痿［5］。综上所述，“髓减”是“骨痿”发生的基本病机，所以历代医家治疗骨质疏松症多从补肾入手，将“补肾益精生髓”作为治疗该病的基本大法。本研究结果显示，大鼠切除卵巢后骨丢失显著增加，BV/TV以及TBV%显著减少;而代表骨吸收指标的TＲS%和TＲS/TFS以及代表骨形成指标的TFS%均显著增高，说明卵巢切除所造成的是一种骨吸收和骨形成均增高，但由于骨吸收大于骨形成，进而导致骨量丢失的高转换型骨质疏松症。病理观察显示，模型组大鼠胫骨骨小梁较假手术组显著减少，其排列稀疏、间距加宽发生“骨痿”。同时，髓腔中的脂肪细胞较假手术组显著增多，而其他骨髓细胞相对减少。形态计量结果进一步显示，模型组TBV%显著减少的同时，其ABS%显著增高。脂肪细胞的显著增多，导致其他骨髓细胞明显减少，即出现了“髓减”。这一结果说明，“髓减”与“骨痿”之间存在着密切联系。而采用左归丸补肾后，在骨小梁明显增多的同时，髓腔中ABS%明显下降，即髓腔中的脂肪细胞明显减少，而骨髓细胞明显增多，从而进一步证明中医“髓减致痿”病机的正确性，同时也说明“肾主骨”理论的科学性。

现代研究表明，大鼠脂肪基质干细胞(adiposetissue-derivedmesenchymalstemcells，ADSCs)具有多向分化潜能，在体外经诱导剂诱导后显示出较强的成骨分化能力。雌二醇可促进ADSCs的增殖，并能提高其向成骨细胞分化的能力［6-8］。本实验结果显示，去卵巢大鼠补充雌二醇后骨髓中的脂肪细胞明显减少，而其他骨髓细胞明显增多，从而说明雌激素在诱导脂肪基质干细胞向其他骨髓细胞的转化过程中起重要作用，给予去卵巢大鼠左归丸后也产生了同样的结果。据此推测，补肾可能有促进脂肪基质干细胞向成骨细胞分化的能力，进而使脂肪细胞明显减少，而使其他骨髓细胞相应增加，即通过“增髓”而达到治疗“骨痿”的作用，对此还有待进一步的深入研究。

参考文献:

［1］鞠大宏，张丽坤，赵红艳，等．滋阴补肾法对卵巢切除所致骨质疏松大鼠骨髓基质细胞IL-1和成骨细胞IL-6表达的影响［J］．中国中医基础医学杂志，2005，11(7):495-498．

［2］章明放，张乃鑫，谭郁彬．运动对雌性大鼠去势后骨质疏松症的作用［J］．中华骨科杂志，1994，14(6):365-369．

［3］付小卫，宋长恒，张治国，等．从OPG-ＲANKL破骨细胞调控通路和Wnt成骨细胞调控通路探讨“肾主骨”的性别差异及其机制［J］．中国中医基础医学杂志，2016，22(1):66-72．

［4］辛小玲，李兆弟，于峥，等．骨痿的病因病机［J］．中国中医基础医学杂志，2012，18(5):470．

［5］赵红霞，于智敏，鞠大宏，等．骨质疏松症的中医证候病机研究［J］．中国中医基础医学杂志，2008，14(10):723-724．

［6］陈昕，丁寅，蔡川，等．雌激素对老年大鼠脂肪干细胞体外诱导成骨能力的影响［J］．口腔医学研究，2010，26(3):340-342．